技术领域
[0001] 本发明涉及多糖特别是透明质酸或其盐的喷雾干燥。
背景技术

[0002] 透明质酸（HA）是一种天然的线性碳水化合物聚合物，属于非硫酸化糖胺聚糖类。其由β-1,3-N-乙酰葡糖胺和β-1,4-葡糖醛酸重复二糖单元组成，分子量（MW）达10MDa。

申请日：2012-05-29
申请人： 诺维信生物制药丹麦公司
发明人 ： K.特梅拉斯 , P.巴赫
IPC分类号： C08B37/00 , B01D1/18 , C08L5/08
CPC分类号： A61K31/728 , C08B37/0072 , C08L5/08

HA见于透明软骨、滑膜关节液和皮肤组织包括表皮和真皮层。
[0003] HA可提取自天然组织，包括脊椎动物的结缔组织、人脐带和鸡冠。然而，现今优选通过微生物方法制备透明质酸，从而使传播传染性病原体的潜在风险最小化，并提升产品一致性、质量和可得性（US6,951,743）。
[0004] 已鉴定HA在人体中的多种作用。它在生物有机体中发挥着重要作用，作为很多组织（如皮肤、腱、肌肉和软骨）的细胞的机械支撑。HA参与关键生物过程，如组织润燥（moistening of tissue）以及润滑。还猜测它在众多生理功能如粘附、细胞运动、癌症、血管发生和伤口愈合中发挥作用。
[0005] 由于HA独特的物理和生物性质（包括粘弹性、生物相容性和生物可降解性），HA在大范围的化妆品、眼科学、风湿病学、药物和基因传递、伤口愈合和组织工程学的当前和开发应用中得以采用。
[0006] WO05/116531描述了一种喷雾干燥透明质酸的方法（分子量为800kDa-参见实施例6）。
[0007] 在对分子量比约1200kDa更高的透明质酸进行喷雾干燥时，可能出现明显的分子量损失。
发明内容
[0008] 本发明涉及对高分子量透明质酸进行喷雾干燥的方法。该方法包括：
[0009] a）将透明质酸喷雾干燥，其中喷雾干燥器进料中的透明质酸的浓度在3.5g/l至7.0g/l的范围内；
[0010] b）使喷雾干燥器进料的温度在0℃至100℃的范围内；且，
[0011] 其中喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量≥1200kDa。
[0012] 本发明的方法降低了经喷雾干燥的透明质酸产品的分子量损失。
具体实施方式
[0013] 本发明涉及对高分子量透明质酸进行喷雾干燥的方法。
[0014] 透明质酸
[0015] “透明质酸”是一种多糖，在本文中定义为由N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）及葡糖醛酸（GlcUA）的重复二糖单元组成的非硫酸化糖胺聚糖，其通过交替的β-1,4和β-1,3糖苷键连接在一起。透明质酸也被称作透明质烷（hyaluronan）、透明质酸盐（hyaluronate）或HA。术语透明质烷和透明质酸在本文中可以互换使用。
[0016] 鸡冠是透明质烷的重要商业来源。微生物是另外可选的来源。美国专利第4,801,539号公开了一种制备透明质酸的发酵方法，其包含兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）的菌株。WO03/054163公开了一种制备透明质酸的发酵方法，其包含芽孢杆菌（Bacillus）宿主。
[0017] 透明质烷合酶被描述为来自脊椎动物、细菌病原体和藻类病毒（DeAngelis,P.L.,1999,Cell.Mol.Life Sci.56:670-682）。WO99/23227公 开 了 来 自 似 马 链 球 菌（Streptococcus equisimilis）的I组透明质酸盐合酶。WO99/51265和WO00/27437描述了来自多杀性巴氏杆菌（Pasturella multocida）的II组透明质酸盐合酶。Ferretti等人公开了酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的透明质烷合酶操纵子，其由三个基因hasA、hasB和hasC组成，分别编码透明质酸盐合酶、UDP葡萄糖脱氢酶和UDP葡萄糖焦磷酸化酶，（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98,4658-4663,2001）。WO99/51265描述了具有似马链球菌透明质烷合酶的编码区的核酸片段。
[0018] 由于重组芽孢杆菌细胞的透明质烷直接表达至培养基中，可使用简单的方法从培养基中分离透明质烷。首先，从培养基中物理去除芽孢杆菌细胞和细胞碎片。如果期望，首先可将培养基稀释，以降低培养基的粘性。用于从培养基去除细胞的许多方法对于本领域技术人员是已知的，例如离心和微滤（microfiltration）。如果期望，然后可将剩余的上清液过滤，例如通过超滤，以浓缩透明质烷并从中去除小分子污染物。去除细胞和细胞碎片之后，通过已知机制从培养基简单沉淀透明质烷。盐、醇或盐和醇的组合可用于从滤液沉淀透明质烷。
[0019] 可以通过使用例如本发明的喷雾干燥法从任何溶液干燥透明质烷，例如从滤液或从再溶解的溶液中干燥透明质烷。
[0020] 宿主细胞
[0021] 优选的实施方式涉及第一方面的产品，其中以重组方式生产透明质酸或其盐，优选通过革兰氏阳性细菌或宿主细胞生产，更优选通过芽孢杆菌属的细菌生产。
[0022] 宿主细胞可以是任何适合于透明质酸重组生产的芽孢杆菌细胞。芽孢杆菌宿主细胞可以是野生型芽孢杆菌细胞或其突变体。可在本发明的实践中使用的芽孢杆菌细胞包括但不限于，Bacillus agaraderhens、嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alkalophilus）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、短芽孢杆菌（Bacillus brevis）、环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）、克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）、灿烂芽胞杆菌（Bacillus lautus）、迟缓芽孢杆菌（Bacillus lentus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）细胞。WO98/22598中记载了特别适于重组表达的突变枯草芽孢杆菌细胞。无被囊的（non-encapsulating）芽孢杆菌属细胞在本发明中是特别有用的。
[0023] 在优选实施方式中，芽孢杆菌属宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。
[0024] 生产
[0025] 在本发明的方法中，使用本领域已知的方法在适合于生产透明质酸的营养培养基中培养细胞（如链球菌属）或宿主细胞（如芽孢杆菌属）。
[0026] 例如，可在实验室或工业发酵罐中通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵（包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵）来培养细胞。
[0027] 使用本领域已知的步骤在包含碳源、氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可以从商业供应商获得，或可以根据已公开的组成（例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中）制备。
[0028] 可以按本领域已知的，例如使用改进的咔唑方法（Bitter and Muir,1962,Anal Biochem.4:330-334），来测定透明质酸的水平。
[0029] 分子量
[0030] 可以按本领域已知的来测定透明质酸的平均分子量。
[0031] 特别地，可以使用本领域的标准方法测定透明质酸的平均分子量，例如由Ueno等 ,1988,Chem.Pharm.Bull.36,4971-4975;Wyatt,1993,Anal.Chim.Acta272:1-40； 和Wyatt Technologies,1999,“Light Scattering University DAWN Course Manual”和“DAWN EOS Manual”Wyatt Technology Corporation,Santa Barbara,California所描述的那些方法。
[0032] 透明质酸的分子量测定也可采用GPC-RI-LS进行，其中透明质酸的分子量测定采用GPC联用示差RI和多角度光散射检测器进行。
[0033] 在优选的实施方式中，喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量为至少1200kDa；特别地，喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至10,000kDa的范围内；优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至9,500kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至9,000kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至8,500kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至8,000kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至7,500kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在
1200kDa至7,000kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至6,500kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至
6,000kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至5,500kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至5,000kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至4,500kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至4,000kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至3,500kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至3,000kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至2,900kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至2,800kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在
1200kDa至2,700kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至2,600kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至
2,500kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至2,400kDa的范围内；更优选喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至2,300kDa的范围内；特别地，喷雾干燥器进料中的透明质酸的分子量在1200kDa至2,200kDa的范围内。
[0034] 在优选的实施方式中，喷雾干燥过程中透明质酸的分子量损失低于15%；例如，喷雾干燥过程中透明质酸的分子量损失低于14%；喷雾干燥过程中透明质酸的分子量损失低于13%；喷雾干燥过程中透明质酸的分子量损失低于12%；喷雾干燥过程中透明质酸的分子量损失低于11%；喷雾干燥过程中透明质酸的分子量损失低于10%；喷雾干燥过程中透明质酸的分子量损失低于9%；喷雾干燥过程中透明质酸的分子量损失低于8%；喷雾干燥过程中透明质酸的分子量损失低于7%；喷雾干燥过程中透明质酸的分子量损失低于6%；特别地，喷雾干燥过程中透明质酸的分子量损失低于5%。
[0035] HA盐
[0036] 优选的实施方式涉及包括透明质酸的盐的产品；特别是包含透明质酸的无机盐的产品；优选包括透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铵、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌或透明质酸钴的产品。
[0037] 衍生化的HA
[0038] 根据本发明进行喷雾干燥的透明质酸可以如本领域已知的进行衍生化或修饰。
[0039] HA可以以多种不同方式进行衍生化或修饰，例如，如在WO2007/033677中所描述的，其中透明质酸（HA）可与芳基或烷基琥珀酸酐（ASA）反应，产生包括n个重复单元且在pH8-9下具有结构通式（I）的芳基/烷基琥珀酸酐HA衍生物：
[0040]
[0041] 其中在至少一个重复单元中，R1、R2、R3、R4中的一个或多个包括在pH8-9下具有结构通式（II）的酯键合的烷基/芳基琥珀酸，否则R1、R2、R3、R4为羟基OH：
[0042]
[0043] 其中R5、R6、R7、R8中的至少一个包括烷基或芳基，否则R5、R6、R7、R8是氢原子H，其中标记“酯”的氧参与与结构（I）形成的酯键。
[0044] 可以如WO2007/106738中所记载的对HA进行衍生化或修饰，其中按以下方式制备丙烯酸酯化（acrylated）的透明质酸：
[0045] （a）制备包含透明质酸的pH为7～11的水性液体；
[0046] （b）制备包含丙烯酰氯和二氯甲烷/乙醚的有机液；和
[0047] （c）将（b）的有机液与（a）的水性液体混合，其中pH维持在7～11。
[0048] 丙烯酸酯化的透明质酸产物具有以下结构：
[0049]
[0050] 其中R1选自氢、甲基、氯和COCl，R2选自氢、甲基、苯基、氯、2-氯苯基、COCl和CH2COCl，R3选自氢、甲基、氯、4-硝基苯基、3-三氟甲基苯基和苯乙烯基部分。
[0051] 喷雾干燥器进料
[0052] 喷雾干燥器进料中的透明质酸的浓度应在3.5g/l～7.0g/l的范围内；例如，在3.6g/l～7.0g/l的范围内；在3.7g/l～7.0g/l的范围内；在3.8g/l～7.0g/l的范围内；在3.9g/l～7.0g/l的范围内；在4.0g/l～7.0g/l的范围内；在4.0g/l～6.9g/l的范围内；在4.0g/l～6.8g/l的范围内；在4.0g/l～6.7g/l的范围内；在4.0g/l～6.6g/l的范围内；在4.0g/l～6.5g/l的范围内；在4.0g/l～6.4g/l的范围内；在4.0g/l～
6.3g/l的范围内；在4.0g/l～6.2g/l的范围内；在4.0g/l～6.1g/l的范围内；特别地，在4.0g/l～6.0g/l的范围内。
[0053] 其他成分
[0054] 在根据本发明的一个实施方式中，包含透明质酸的进料还可包含其他成分，例如活性成分和/或赋形剂。
[0055] 可用于本发明的活性成分或药理学活性物质的非限制性实例包括蛋白质和/或肽药物。
[0056] 蛋白质和/或肽药物的实例为，人生长激素、牛生长激素、猪生长激素、生长激素释放激素/肽、粒细胞-集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子、巨噬细胞-集落刺激因子、红细胞生成素、骨形态发生蛋白、干扰素或其衍生物、胰岛素或其衍生物、心房肽激素III（atriopeptin-III）、单克隆抗体、肿瘤坏死因子、巨噬细胞活化因子、白介素、肿瘤变性因子（tumor degenerating factor）、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、组织纤溶酶原激活物、因子IIV、因子IIIV和尿激酶。
[0057] 根据本发明可以例如出于稳定活性成分的目的包括赋形剂，这些赋形剂可包括蛋白质，例如白蛋白或明胶；氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸及其盐；碳水化合物如葡萄糖、乳糖、木糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、甘露醇、山梨糖醇、海藻糖和硫酸软骨素；无机盐如磷酸盐；表面活性剂如 （ICI）、聚乙二醇及其混合物。
[0058] 喷雾干燥
[0059] 喷雾干燥涉及将液体进料雾化成液滴喷雾以及在干燥室中使液滴与热空气接触。通过旋转（轮）雾化器或喷嘴雾化器产生喷雾。
[0060] 根据雾化原理，液滴大小通常在10～100微米的范围内。有两种主要类型的喷嘴：高压单流体喷嘴（50～500巴）和双流体喷嘴：第一流体是要干燥的液体，第二流体是压缩气体（一般是2～7巴的空气）。
[0061] 从液滴蒸发水分并形成干燥颗粒在受控的温度和气流条件下进行。粉末不断从干燥室排出。根据目标产品的干燥特性来选择操作条件。
[0062] 根据本发明，可以使用本领域已知的任何喷雾干燥器，但在本方法的一个实施方式中，使用双流体喷嘴（TFN）或旋转式雾化器进行喷雾干燥步骤。
[0063] 可使用100℃至200℃的进口温度进行喷雾干燥；优选120℃至200℃的进口温度；特别是140℃至200℃的进口温度。
[0064] 可使用40℃至95℃的出口温度进行喷雾干燥；优选50℃至94℃的出口温度；优选60℃至94℃的出口温度；特别是70℃至93℃的出口温度。
[0065] 可使用0℃至100℃的进料温度进行喷雾干燥；例如1℃至100℃的进料温度；2℃至100℃的进料温度；3℃至100℃的进料温度；4℃至100℃的进料温度；5℃至100℃的进料温度；6℃至100℃的进料温度；7℃至100℃的进料温度；8℃至100℃的进料温度；9℃至100℃的进料温度；10℃至100℃的进料温度；11℃至100℃的进料温度；12℃至100℃的进料温度；13℃至100℃的进料温度；14℃至100℃的进料温度；15℃至100℃的进料温度；16℃至100℃的进料温度；17℃至100℃的进料温度；18℃至100℃的进料温度；19℃至100℃的进料温度；20℃至100℃的进料温度；21℃至100℃的进料温度；22℃至100℃的进料温度；23℃至100℃的进料温度；24℃至100℃的进料温度；25℃至100℃的进料温度；26℃至100℃的进料温度；27℃至100℃的进料温度；28℃至100℃的进料温度；29℃至100℃的进料温度；30℃至100℃的进料温度；31℃至100℃的进料温度；32℃至100℃的进料温度；33℃至100℃的进料温度；34℃至100℃的进料温度；35℃至100℃的进料温度；36℃至100℃的进料温度；37℃至100℃的进料温度；38℃至100℃的进料温度；39℃至100℃的进料温度；40℃至100℃的进料温度；41℃至100℃的进料温度；42℃至100℃的进料温度；43℃至100℃的进料温度；44℃至100℃的进料温度；45℃至100℃的进料温度；46℃至100℃的进料温度；47℃至100℃的进料温度；48℃至100℃的进料温度；49℃至100℃的进料温度；50℃至100℃的进料温度；51℃至100℃的进料温度；52℃至100℃的进料温度；53℃至100℃的进料温度；54℃至100℃的进料温度；55℃至100℃的进料温度；56℃至100℃的进料温度；57℃至100℃的进料温度；58℃至100℃的进料温度；59℃至100℃的进料温度；60℃至100℃的进料温度；61℃至100℃的进料温度；62℃至100℃的进料温度；63℃至100℃的进料温度；64℃至100℃的进料温度；65℃至100℃的进料温度；66℃至100℃的进料温度；67℃至100℃的进料温度；68℃至100℃的进料温度；69℃至100℃的进料温度；70℃至100℃的进料温度；特别是70℃至99℃的进料温度。
[0066] 喷嘴空气温度通常会在10℃至100℃；特别是在20℃至90℃。
[0067] 旋转式雾化器的圆周速度通常会在50m/s至250m/s。
[0068] 根据本发明，可便利地通过喷雾干燥先产生干燥细粉。然后可在流化床和液体粘合剂中将所述细粉液化，例如将水喷到设备上形成附聚物。
[0069] 实施例
[0070] 实施例1
[0071] 使用进料中透明质酸（HA）浓度、进料温度及雾化原理的不同组合进行喷雾干燥。
[0072] 以HA浓度、进料温度和雾化原理（外部TFN或旋转式雾化器）的不同组合在小中试规模喷雾干燥器（Minor pilot scale spray dryer，MM）中来运行HA。所有实验均在GEA移动型小中试规模喷雾干燥器（MM）上进行。
[0073] 测量以下参数：送至喷雾干燥器的进料中的HA分子量（MW），产品中的HA分子量以及粒径分布（PSD）。
[0074] 所有实验均以195℃的干燥室进口温度（Tin）、85℃的出口温度（Tout）和约80kg/h的干燥气流进行。
[0075] 表1总结了雾化原理为旋转喷雾的结果，表2总结了雾化原理为TFN的结果。
[0076] 表1.
[0077]
[0078] 表2.
[0079]
[0080] 产品无一表现出任何变色。
[0081] 对表1和表2结果的统计分析表明，使用较高的进料HA浓度使喷雾干燥过程中的分子量损失明显降低。
[0082] 实施例2
[0083] 对不同分子量的透明质酸进行喷雾干燥
[0084] 在装备有外部双流体喷嘴（TFN）的中试规模流化喷雾干燥器（FSD）上对不同批次的具有不同HA分子量（MW）和浓度的透明质酸（HA）的进料进行喷雾干燥。
[0085] 表3概述了进料浓度、HA分子量和干燥产品的HA分子量。
[0086] 所有批次以195℃的干燥室进口温度、89℃的空气出口温度和95℃的进料温度进行喷雾干燥。
[0087] 产品无一表现出任何变色。
[0088] 表3.
[0089]
[0090] 实施例3
[0091] 使用进料中透明质酸（HA）浓度、进料温度及雾化原理的不同组合进行喷雾干燥。
[0092] 以HA浓度、进料温度和雾化原理（外部TFN或旋转式雾化器）的不同组合在小中试规模喷雾干燥器中来运行HA。所有实验均在GEA移动型小中试规模喷雾干燥器（MM）上进行。
[0093] 测量以下参数：进料中的HA分子量（MW），产品中的HA分子量以及粒径分布（PSD）。
[0094] 所有实验均以195℃的干燥室进口温度（Tin）、90℃的出口温度（Tout）和约80kg/h的干燥气流进行。
[0095] 表4总结了该结果：